RESUMO: Uma das mudanças que ocorrem no gene PRNP em bovinos é a inserção e/ou deleção (indels) de sequências de bases, em determinadas regiões como, por exemplo, as indels de 12 pares de bases (pb) no íntron 1 e 23pb na região promotora. O alelo de deleção de 23pb está relacionado com a suscetibilidade à Encefalopatia Espongiforme Bovina (EEB), assim como a presença do alelo de deleção de 12pb. Neste estudo foi genotipada a variabilidade de nucleotídeos da região promotora e íntron 1 do gene PRNP em bovinos das raças Angus, Canchim, Nelore e Simental, para identificar os perfis genotípicos de resistência e/ou suscetibilidade à EEB de cada animal. Foi realizada a extração de DNA genômico para amplificação das regiões alvo do gene PRNP, por meio da reação em cadeia de polimerase (PCR) utilizando-se primers específicos. Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 3%, e sequenciamento para a realização da genotipagem. Com exceção da raça Angus, a maioria das raças apresentaram maiores frequências do alelo de deleção tanto para 12pb como 23pb, em comparação com seus respectivos alelos de inserção, para as duas regiões. Esses resultados abrem caminhos para o conhecimento de como o rebanho brasileiro está sendo formado com relação aos polimorfismos do gene PRNP bovino.

ABSTRACT: One of the alterations that occur in the PRNP gene in bovines is the insertion/deletion (indel) of base sequences in specific regions, such as indels of 12-base pairs (bp) in intron 1 and of 23- bp in the promoter region. The deletion allele of 23 bp is associated with susceptibility to bovine spongiform encephalopathy (BSE) as well as the presence of the deletion allele of 12 bp. In the present study, the variability of nucleotides in the promoter region and intron 1 of the PRNP gene was genotyped for the Angus, Canchim, Nellore and Simmental bovine breeds to identify the genotype profiles of resistance and/or susceptibility to BSE in each animal. Genomic DNA was extracted for amplification of the target regions of the PRNP gene using polymerase chain reaction (PCR) and specific primers. The PCR products were submitted to electrophoresis in agarose gel 3% and sequencing for genotyping. With the exception of the Angus breed, most breeds exhibited a higher frequency of deletion alleles for 12 bp and 23 bp in comparison to their respective insertion alleles for both regions. These results represent an important contribution to understanding the formation process of the Brazilian herd in relation to bovine PRNP gene polymorphisms.

Objetivou-se no presente estudo avaliar as técnicas reação em cadeia da polimerase (PCR) e PCR em Tempo Real (qPCR) para detectar Brucella abortus, a partir de tecidos bovinos com lesões sugestivas de brucelose. Para isto, 21 fragmentos de tecidos bovinos coletados em abatedouros de Mato Grosso do Sul foram processados e submetidos ao cultivo microbiológico e extração do DNA genômico para realização das reações de PCR e qPCR. No cultivo microbiológico, oito amostras apresentaram crescimento bacteriano e cinco foram confirmadas como B. abortus por PCR. Diretamente das amostras de tecido, DNA do gênero Brucella (oligonucleotídeos IS711) foi detectado em 13 (61,9%) amostras de tecido e 17 (81%) amostras de homogeneizado. Já com os oligonucleotídeos espécie-específicos BruAb2_0168F e BruAb2_0168R, 14 (66%) amostras de tecido e 18 (85,7%) amostras de homogeneizado foram amplificadas. Seis amostras positivas na PCR espécie-específica foram sequenciadas e o best hit na análise BLASTn foi B. abortus. Na qPCR, 21 (100%) amostras de tecidos e 19 (90,5%) amostras de homogeneizado foram positivas para B. abortus. Dez amostras de DNA de sangue bovino de rebanho certificado livre foram utilizadas como controle negativo nas análises de PCR e qPCR utilizando-se os oligonucleotídeos BruAb2_0168F e BruAb2_0168R. Na PCR nenhuma amostra amplificou, enquanto que na qPCR 2 (20%) amplificaram. Conclui-se que as duas técnicas detectam a presença de B. abortus diretamente de tecidos e homogeneizados, porém a qPCR apresentou maior sensibilidade. Os resultados obtidos indicam que a qPCR pode representar uma alternativa rápida e precisa para a detecção de B. abortus diretamente de tecidos, e ser utilizada em programas de vigilância sanitária, por apresentar sensibilidade e especificidade satisfatórias.

The aim of the study was to evaluate the technical polymerase chain reaction (PCR) and Real-Time PCR (qPCR) to detect Brucella abortus from bovine tissues with suggestive lesions of brucellosis. For this, 21 fragments of bovine tissues collected at abattoirs of Mato Grosso do Sul were processed and subjected to microbiological culture and extraction of genomic DNA to perform the PCR reactions and qPCR. Eight samples of microbiological culture showed bacterial growth and five samples were confirmed as B. abortus by PCR. DNA of Brucella (IS711 primers) was detected in 13 (61.9%) directly from tissue samples and 17 (81%) from tissue homogenate samples. With the species-specific set of primers BruAb2_0168F and BruAb2_0168R, 14 (66%) tissue samples and 18 (85.7%) tissue homogenate samples were positive. Six positive samples in the species-specific PCR were sequenced and the best hit in the BLASTn analysis was B. abortus. By qPCR, 21 (100%) tissue samples and 19 (90.5%) tissue homogenate samples were positive for B. abortus. Ten samples of DNA from bovine blood from an accredited-free herd were used as negative control in PCR and qPCR analysis using the primers BruAb2_0168F and BruAb2_0168R, and no one amplified by PCR, whereas two samples were amplified by qPCR (20%). In conclusion, both techniques detect the presence of B. abortus directly from tissues and homogenized, but the qPCR showed high sensitivity. The results indicate that qPCR can represent an alternative tool for faster and more accurate detection of B. abortus directly from tissues, and use in health surveillance programs by presenting satisfactory sensitivity and specificity.

A prevenção contra infecções causadas por Brucella abortus em bovinos é realizada por meio da administração das amostras vacinais B19 e RB51. Existem relatos de que estas vacinas podem causar aborto em fêmeas vacinadas. Portanto, toda a ocorrência de aborto em animais vacinados merece um estudo aprofundado sobre a causa. No Brasil, não há registro sobre a origem das amostras B19 e RB51 utilizadas na produção das vacinas comerciais. Assim, um estudo para verificar possíveis mutações em relação às amostras referência USDA B19 e USDA RB51 de B. abortus se faz necessário, devido às amostras vacinais poderem reverter a sua virulência. Objetivou-se com este estudo caracterizar genotipicamente as amostras vacinais B19 e RB51 comercializadas no Brasil. A metodologia utilizada foi a genotipagem de genes marcadores destas amostras vacinais, por meio da amplificação pela reação em cadeia da polimerase. Os resultados obtidos permitiram a identificação do genótipo das vacinas comerciais B19 e RB51 disponíveis e utilizadas em bovinos no Brasil. A ausência de mutações nas vacinas testadas corrobora com a qualidade genética das mesmas, quanto à estabilidade dos genes analisados.

Vaccine strains B19 and RB51 are administered to cattle for prevention against infection by Brucella abortus. However, there are reports that these vaccines can cause miscarriages. Thus, every miscarriage among vaccinated animals should be thoroughly studied to determine the cause. In Brazil, there are no records on the origin of B19 and RB51 samples used in the preparation of commercial vaccines. Therefore, a study is needed to determine possible mutations in relation to the USDA reference samples of B. abortus due to the fact that vaccine samples could revert to the virulence of the disease. The aim of the present study was to perform a genotype analysis of vaccine strains B19 and RB51 used in Brazil. The methodology was based on the genotyping of marker genes of these vaccine strains by amplification using polymerase chain reaction. The results allowed the identification of the genotype of the B19 and RB51 commercial vaccine available for use on cattle in Brazil. The absence of mutations in the samples tested confirmed the genetic quality of the vaccines and stability of genes analyzed.

A presença de Brucella spp. entre animais silvestres pode influenciar a taxa de reprodução destes hospedeiros, além de atuarem como fonte de infecção natural para os animais domésticos e humanos. O objetivo deste estudo foi identificar a presença de Brucella spp. em 44 amostras de sangue de veado campeiro (Ozotoceros bezoarticus) do Pantanal do Sul-Mato-Grossense, utilizando a técnica de PCR. Observou-se que 20,4% (9/44) das amostras foram positivas. A sequência consenso de nucleotídeo obtida no sequenciamento do isolado de veado campeiro apresentou 514 pb e 95% de identidade com virB5 de B. abortus (best hits acesso nr AF226278, e-value 0.0), já na análise filogenética a amostra de Brucella isolada de veado campeiro apresentou-se muito próximo de B. suis. A alta porcentagem de amostras positivas sugere que a brucelose pode ser um problema entre os veados campeiros na área estudada e que estes animais podem representar riscos para outros animais domésticos e silvestres.

The presence of Brucella spp. in wild animals can influence their reproduction rate and may be a source of infection for domestic animals and humans. The objective of this study was to identify the presence of Brucella spp. in 44 blood samples from the deer Ozotoceros bezoarticus in the southern Pantanal of Sul-Mato-Grossense, using the PCR technique. It was seen that 20.4% (9/44) of the samples were positive. The consensus sequence was obtained by sequencing these samples, which then showed 514 pb and 95% of identity with gene virB5 of B. abortus (best hits accession nr AF226278, e-value 0.0). The phylogenetic analysis of the sample isolated from deer revealed the Brucella to be very close to B. suis. The high percentage of positive samples suggests that brucellosis may be a concern in deer within the studied area, and that these animals may poses a risk for other domestic and wild ones.

Brucella spp. são bactérias gram-negativas, intracelulares facultativas que são patogênicas para muitas espécies de mamíferos causando a brucelose, uma zoonose difundida mundialmente. Por isso a busca de alternativas de controle mais eficientes se faz necessário como o desenvolvimento de novas cepas que possam ser testadas como potenciais imunógenos. Neste estudo realizou-se a deleção do gene virB10 da cepa S2308 de Brucella abortus gerando uma cepa knockout provavelmente incapaz de produzir a proteína nativa correspondente. O gene virB10 faz parte de um operon que codifica para um sistema de secreção do tipo IV, essencial para a sobrevivência intracelular e multiplicação da bactéria em células hospedeiras. A deleção foi realizada pela construção do plasmídeo suicida pBlue:virB10:kan e eletroporação deste em células eletrocompetentes de B. abortus S2308, ocorrendo a troca do gene selvagem pelo gene interrompido, com o gene de resistência a canamicina, por recombinação homóloga dupla. Camundongos BALB/c foram inoculados com as cepas S19, RB-51, ΔvirB10 de B. abortus e B. abortus S2308 selvagem; os resultados demonstraram que camundongos BALB/c inoculados com S19 e camundongos BALB/c inoculados com S2308 apresentaram queda mais rápida de linha de tendência, quando comparadas aos demais grupos, para recuperação bacteriana (RB) e peso esplênico (PE) respectivamente. Os grupos que receberam ΔvirB10 S2308 de B. abortus e RB-51 demonstraram comportamento semelhante para ambas as características. Na sexta semana após a inoculação, os resultados para RB (log de UFC ± desvio padrão) e PE (peso esplênico ± desvio padrão), respectivamente, mostraram: grupos inoculados com as cepas S2308 (4,44±1,97 e 0,44±0,11), S19 (1,83±2,54 e 0,31±0,04), RB-51 (0,00±0,00 e 0,20±0,01) e ΔvirB10 S2308 (1,43±1,25 e 0,19±0,03). Considerado o clearance bacteriano, todos os grupos diferiram estatisticamente do grupo que recebeu S2308 (p<0,0001), o grupo inoculado com ΔvirB10 S2308 de B. abortus foi semelhante ao grupo S19 (p=0,4302) e diferente do grupo RB-51 (p=0,0063). A avaliação da persistência revelou que o gene virB10 é essencial para a manutenção da virulência da bactéria. Os resultados obtidos possibilitarão que outras pesquisas sejam realizadas avaliando o potencial imunogênico desta cepa mutante.

Brucella spp. are intracellular facultative gram-negative bacteria which are pathogenic for many species of mammals, causing brucellosis, a worldwide spread zoonosis. Therefore the search for more efficient alternatives of control, as the development of new potential immunogens is necessary. In this study, we knockouted virB10 from Brucella abortus S2308 strain, generating a mutant strain probably incapable to produce the corresponding native protein. The gene virB10 is part of an operon that codifies for type IV secretion system, which is essential for the intracellular survival and multiplication of the bacteria in host cells. The knockout was carried through by the construction of the suicidal plasmid pBlue: virB10: kan and eletroporation in eletrocompetent cells of B. abortus S2308, leading to the exchange of the wild gene for the interrupted gene, containing the gene of resistance to kanamycin, for double homologous recombination. BALB/c mice were inoculated with S19, RB-51, ΔvirB10 strains of B. abortus and S2308 wild strain; the results demonstrated that the BALB/c mice inoculated with S19 and BALB/c mice inoculated with S2308 presented faster fall of trend line, when compared with the too much groups, for bacterial recovery (BR) and esplenic weight (EW) respectively. The groups that received ΔvirB10 S2308 B. abortus and RB-51 demonstrated similar behavior for both the characteristics. In the sixth week postinoculation, the results for BR (log UFC ± standart deviations) and EW (esplenic weight ± standart deviations), respectively, showed: groups inoculated with strains S2308 (4,44±1,97 and 0,44±0,11), S19 (1,83±2,54 and 0,31±0,04), RB-51 (0,00±0,00 and 0,20±0,01) and ΔvirB10 S2308 (1,43±1,25 and 0,19±0,03). Considered the bacterial clearance, all the groups differed statistical from the group that received S2308 (p<0,0001), the group inoculated with ΔvirB10 S2308 B. abortus was similar to the S19 group (p=0,4302) and different of group RB-51 (p=0,0063). The evaluation of the persistence of the strains showed that virB10 is essential for the maintenance of the virulence. These results support other studies concerning the immunogenic potential of this mutant strain.

Os objetivos deste estudo foram produzir e solubilizar a proteína MSP5 recombinante truncada de Anaplasma marginale, e avaliar seu desempenho em um ensaio de imunoadsorção enzimática indireto (ELISA) para detecção de anticorpos contra a riquétsia. O gene msp5, exceto a região N-terminal hidrofóbica, foi amplificado por PCR, clonado em plasmídeo pTrcHis-TOPO e expresso em Escherichia coli. A solubilização da proteína recombinante foi avaliada em diferentes pHs e concentrações de uréia. A sensibilidade e a especificidade do ensaio foram avaliados testando-se 66 soros de animais infectados experimentalmente com A. marginale e 96 soros negativos, com o estado de infecção destes animais confirmado por PCR. Um total de 1.666 amostras de soros bovino, provenientes do Brasil - Rio Grande do Sul (73), Mato Grosso do Sul (91), Pernambuco (86), Bahia (314) e Minas Gerais (267)-, Uruguai (32) e Costa Rica (803) foram testadas nos ELISAs com MSP5 truncada e com MSP1a recombinantes e a concordância entre os dois testes foi avaliada. O ELISA indireto com MSP5 truncada foi capaz de detectar animais infectados com 96,97% de sensibilidade e 100% de especificidade. Nos animais infectados experimentalmente, o ELISA detectou anticorpos do 12º até o último dia de observação (37º dia). Os ELISAs para MSP5 e MSP1a apresentaram concordância de 95,67%, com índice kappa de 0,81. Os resultados discordantes apresentaram uma diferença significativa (p <0,001). Anticorpos contra A. marginale foram detectados em animais de todas as regiões estudadas. O ELISA com MSP5 recombinante truncada apresentou bom desempenho na detecção de anticorpos contra A. marginale, com alta sensibilidade e especificidade, representando uma importante ferramenta para o diagnóstico da anaplasmose bovina em estudos epidemiológicos.

The objective of this study was the production and solubilization of recombinant truncated MSP5 of Anaplasma marginale and the evaluation of its performance in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), to detect antibodies against the rickettsia in cattle. The fragment of msp5 gene, except the hydrophobic N-terminal region, was amplified by PCR, cloned in pTrcHis-TOPO plasmid and expressed in Escherichia coli. Solubilization of the recombinant protein was evaluated in different pHs and concentrations of urea. The sensibility and specificity of the assay were evaluated with 66 sera from cattle experimentally-infected and 96 sera from cattle free of A. marginale defined by polymerase chain reaction for msp5 gene. Serum samples from 1,666 cattle from Brazil - states of Rio Grande do Sul (73), Mato Grosso do Sul (91), Pernambuco (86), Bahia (314) and Minas Gerais (267), Uruguay (32) and Costa Rica (803), were tested by ELISAs with recombinant truncated MSP5 and with recombinant MSP1a, and the agreement between both ELISAs was calculated. ELISA with recombinant truncated MSP5 protein detected infected animals with sensibility of 96.97% and specificity of 100%. In cattle experimentally-infected, the ELISA detected antibodies from the 12th day post-infection (DPI) to the end of the experiment, at the 37th DPI. The agreement between the ELISAs with truncated MSP5 and MSP1a antigens was 95.67%, with a kappa index of 0.81. Disagreement results showed significative difference (p <0.001). Antibodies for A. marginale were detected in animals of the all the region analyzed. The ELISA with recombinant truncated MSP5 showed a good performance in ELISA for detention of antibodies against A. marginale, with high sensitivity and specificity, representing an important tool for the diagnosis of anaplasmose bovine in epidemiological studies.